Este guia ajudará seu site quando você perceber que a remoção de RNA corrige problemas de tecido.

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Problema: O DNA genômico funciona no RNA.Problema: Altamente para escolher entre RNA / integridade degradada.Problema: Inibidores dentro do RNA.Problema: baixo rendimento de RNA.

Por que a extração de RNA é difícil?

O RNA é geralmente de fita simples, enquanto o DNA é principalmente de fita dupla. O isolamento de RNA intacto é muitas vezes problemático. As RNases, um grande grupo relativo às enzimas que quebram os elementos de RNA, são encontradas em abundância em todo o mundo, inclusive nas mãos e também em alguns lugares, e as RNases seriam difíceis de remover / remover completamente.

Precisa de ajuda para purificar o RNA com o mais importante Kit Monarch Total RNA Miniprep (NEB # T2010)? Estamos aqui para aconselhar. O guia abaixo Este prospecto de guia de solução de problemas lista alguns dos pontos fracos mais comuns enfrentados pelos especialistas do setor em purificação de RNA. Ainda tem problemas de energia logo após a verificação? Entre em contato com o suporte técnico a qualquer momento.

PROBLEMA Motivo SOLUÇÃO

Sorriso bêbado Digestão insuficiente e homogeneização do modelo

  • Aumento da decomposição da amostra um pouco de tempo além da homogeneização
  • Após a digestão com Proteinase K, centrifugar a própria amostra, homogeneizar se necessário para formar um precipitado e, se possível, consumir o sobrenadante para as próximas etapas
  • Use um volume maior ligado com Reagente de Proteção de DNA/RNA (NEB # T2011) e/ou Tampão de Lise de RNA (NEB # T2012) quando precisar romper amostras e homogeneizar. Consulte também o manual do produto para obter exemplos de todos os protocolos específicos da Internet.
  • Amostra muito grande

  • Reduza a grande variedade de material de origem para atender às especificações especificadas, para que possamos garantir que haja barreira suficiente e que a coluna esteja longe de sobrecarregada. Consulte a seleção de volumes de injeção ou o guia do produto.
  • Baixo rendimento Eluição incompleta

  • Depois de adicionar regular sem nuclease (NEB # B1500) à matriz do pedido, incubar por 5 a 10 minutos usando temperatura ambiente e centrifugar se quiser eluir
  • Realize outra eluição (dica: a enfraquecerá a amostra)
  • Amostra danificada

  • Salve a música inserida a -80 ° C recentemente
    . Ligar de volta
  • Use Monarch DNA per RNA Protection Reagent (NEB # T2011) se você quiser preservar normalmente a integridade do RNA nesta área específica que está sendo usada
  • Dissolução ou homogeneização insuficiente

  • Estenda o tempo de digestão ou homogeneização da amostra
  • Após a absorção ou homogeneização da proteinase K, centrifugar a amostra para peletizar a sujeira e usar apenas o sobrenadante para as próximas etapas.
  • Use qualquer tipo de um volume maior de reagente de DNA/RNA (NEB # T2011) e – ou tampão de lise de RNA (NEB número T2012) para ruptura e mogenização de g. Consulte revistas de design específicas referentes à Internet ou no guia de respostas.
  • Em amostras tratadas com proteinase K, a duplicação da proteinase K (de 5% para 10%) leva a um aumento significativo no rendimento de RNA com sucesso.
  • Amostra muito grande

  • Diminua você vê, a quantidade de acordo com o material que corresponde às especificações do kit para oferecer buffer suficiente e evitar o excesso de carga da coluna. Consulte Insira a quantidade para seleção ou talvez o Guia do produto.
  • degradação de RNA Matérias-primas são manuseadas/armazenadas incorretamente

  • Armazene a amostra de entrada a -80 ° C antes de poder usar o aplicativo. A degradação do RNA é possível se sua amostra não estiver protegida simplesmente por manipulação ultrarrápida do ombro ou por um reagente impressionante de recursos. Use Monarch Protection DNA per RNA Reagent (NEB # T2011) para manter a integridade do RNA durante o armazenamento.
  • O desvio do protocolo especificado vai expor o RNA à atividade indesejada da RNase

  • Leia as diretrizes gerais de Manuseio de RNA ou Guia do Produto.
  • Bactérias RNase de materiais eluídos ou tampões de procedimento podem ter ocorrido

  • Você encontrará muitas dicas para reduzir o risco real de infecção nas diretrizes militares para manuseio de RNA ou no manual do produto.
  • Relatórios de OD inválidos Baixo A 260/280 estima indicar proteína residual emamostra limpa

  • Certifique-se de que a etapa da Proteinase K foi usada para alcançar o momento imensamente importante. Certifique-se de que as amostras estejam livres de resíduos antes de adicionar etanol às amostras de teste e carregá-las na coluna de purificação de RNA.
  • Valores baixos de

    A 260/230 indicam que os sais de guanidina ocultos foram levados muito mais fortemente do que durante a eluição

  • Certifique-se de que as etapas de lavagem estejam concluídas antes da eluição da amostra. Certifique-se de que a ponta da coluna nunca entre em contato com a flutuação após o último enxágue. Em caso de dúvida, repita a centrifugação. Se estiver usando cápsulas de coleta, seque a borda da linha d’água de uma pessoa com um Kimwipe antes de colocá-lo na coluna para remover a maior parte do tampão de lavagem residual.
  • contaminação por DNA DNA genômico não coletado no gleam

  • Realize vários tratamentos com DNase I no alto da coluna para remover gDNA pouco atraente da amostra lisada
  • Execute DNase I in vitro e fora da coluna para remover gDNA.
  • Amostra além de grande

  • Reduza o número de partidas para comparar o desempenho do kit com o calço diretamente para garantir que haja o suficiente, além de que a prateleira não está sobrecarregada. Consulte a seleção de quantidades de injeção ou guia de mercadorias.
  • Desempenho ruim com RNA nas etapas subsequentes Sal e adicionalmente / ou transferência de etanol veio

  • Tenha cuidado para não conectar a ponta da coluna de purificação de RNA após a última lavagem. Se não tiver certeza, repita a centrifugação
  • Seja obviamente assistido para girar toda a coluna de purificação de RNA dentro de 2 alguns minutos da fase final do tampão de lavagem de RNA.
  • Ao repetir Ao fazer tubos sequenciados, limpe a borda do tubo principal com um Kimwipe antes de colocá-lo na coluna para obter qualquer tampão de lavagem restante
  • Adicione uma lavagem extra e / nem aumente o tempo de centrifugação de uma última máquina de lavar
  • As leituras espectrofotométricas são estranhas A concentração de RNA é provavelmente muito baixa para análise espectrofotométrica

  • Para uma concentração mais alta de RNA, eluir com 30 µl de bebida sem nuclease
  • Aumente o número de hardware escalonado (dentro da especificação do kit). Consulte a seleção manual de quantidades de injeção ou guia de itens.
  • Sílica fresca em eluato

  • Centrifugue novamente as amostras eluídas e também pipete a alíquota com água suspensa, o que garantirá que A 260/230 seja indubitavelmente possível inalterado.Eluição de bloqueios de sílica
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